Паразитология

Haplozoon Dogiel, 1906 — род одноклеточных эукариот из группы Dinoflagellata (Alveolata), паразитирующих в кишке морских полихет. Представители этого рода обладают рядом черт, не типичных для динофлагеллят: ведут паразитический образ жизни и не имеют жгутика на стадии трофонта, прикрепляются к эпителию кишки хозяина с помощью стилетоподобной органеллы, образуют внутриклеточные компартменты с ядрами, т.е. демонстрируют своего рода функциональную многоклеточность. Известно три типа компартментов клетки: трофомеры (осуществляют прикрепление к эпителию), гономеры (предположительно, специализируются на питании, составляют большую часть тела паразита) и споромеры (образуют задний конец тела, от которого отпочковываются дочерние клетки — предположительно, следующие стадии жизненного цикла паразита). Эти группы компартментов последовательно сменяют друг друга и образуют один или несколько продольных рядов, в случае типового вида Haplozoon armatum — два. Покровы клетки представлены цитоплазматической мембраной и подлежащими амфиесмальными пузырьками (альвеолами). Эти же пузырьки отвечают за разделение компартментов паразита, а также прогибают изнутри цитоплазматическую мембрану, что придает поверхности клетки характерную форму. H. armatum, паразитирующий в полихете Travisia forbesii, был впервые описан более 100 лет назад — в 1906 году — профессором Санкт-Петербургского Императорского университета В.А. Догелем. Однако и сегодня для него существуют только данные световой микроскопии, а данные современного анализа (трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия, молекулярное секвенирование) были представлены для некоторых других видов рода, но не для типового вида. Мы провели исследование с использованием сканирующей электронной микроскопии и сравнили общее строение и поверхностную организацию клетки этого вида со строением других видов рода Haplozoon. Мы представляем новые данные, которые значительно дополняют описание типового вида, делают вклад в познание разнообразия динофлагеллят и расширяют наши представления о паразитических протистах в целом.

Проект выполняется в РЦ СПбГУ (№109-32391).

Гемоспоридии родов Plasmodium, Haemoproteus и Leucocytozoon — одни из самых распространенных кровепаразитов птиц, которые передаются с помощью самок кровососущих двукрылых. Эти паразиты способны вызывать серьезные заболевания, такие как малярия и другие гемоспоридиозы, особенно если птица заражается «новым» для нее видом паразита. В последние годы активно обсуждается проблема изменения климата и влияние этого процесса на распространение гемоспоридий из тропических регионов в северные. Поэтому мониторинговые исследования зараженности птиц гемоспоридиями важны для оценки эпидемиологической обстановки в популяциях диких птиц северных регионов Палеарктики, и, в частности, на территории северной Европы.

Цель нашей работы — исследовать зараженность птиц гемоспоридиями в районе Белого моря. Образцы от 175 воробьиных птиц (26 видов из 10 семейств) были собраны в июне–июле 2022/2023 годов на Биологической станции «Картеш» Зоологического института РАН, которая находится на мысе Картеш Кандалакшского залива Белого Моря (66В°20.230' N; 33В°38.972' E). Зараженность птиц гемоспоридиями оценивалась с помощью микроскопии мазков крови, а также методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-анализа) с амплификацией гена cyt b паразита. Гемоспоридии были обнаружены у почти 40% исследованных птиц. Наиболее распространенными были паразиты родов Haemoproteus и Leucocytozoon (40 и 37 зараженных особей соответственно). Зараженность паразитами рода Plasmodium была низкой, малярия была найдена только у 4 птиц. У 10% исследованных особей было выявлено коинфицирование, в основном паразитами из родов Haemoproteus и Leucocytozoon. Продукты амплификации образцов крови всех инфицированных птиц были секвенированы и использованы для анализа генетического разнообразия гемоспоридий в районе исследования.

Проект выполняется при поддержке гос. Задания ЗИН РАН №122031100261-7.

Тегумент — это своеобразно устроенные покровы паразитических плоских червей (Neodermata), в том числе трематод. Тегумент взрослой гермафродитной особи трематод (мариты) формируется на стадии хвостатой личинки — церкарии. Считается, что у всех трематод механизм формирования тегумента сходный (Галактионов, Добровольский 1998). Сначала эмбрион, состоящий из недифференцированных клеток, покрыт зародышевой мембраной, сформированной за счет слияния нескольких макромеров. Затем под ней обнаруживаются уплощенные клетки, которые сливаются, образуя синцитий. Синцитий утолщается, формируется базальная пластинка, а ядра дегенерируют. Далее, субтегументальные клетки, лежащие глубже в паренхиме, соединяются с синцитием цитоплазматическими мостиками, и таким образом заканчивается формирование тегумента.

Объектом нашего исследования являются цистофорные церкарии надсемейства Hemiuroidea. Их хвост сильно модифицирован, он образует полую хвостовую капсулу, в которую помещено тело инвазионной церкарии, и извергательную трубку, обеспечивающую заражение следующего хозяина. В литературе существует очень мало данных, описывающих ультратонкое строение хвостовой капсулы и развитие этих церкарий. Но есть множество работ, выполненных на светооптическом уровне, которые показывают, что в хвостовой капсуле инвазионных церкарий нет ядер, а стенки капсулы не похожи на живые структуры. Снаружи капсула покрыта тонким слоем, который явно нельзя назвать типичным тегументом. Каким образом формируется и как устроен такой хвост?

В данной работе были исследованы церкарии Derogenes cf. varicus (три близких вида) и Progonus muelleri. Материал был собран в Белом, Баренцевом и Японском морях. Церкарий исследовали с помощью световой, конфокальной, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

Формирование тегумента хвоста отличается от привычного. У эмбрионов в наружной пластинке тегумента присутствуют ядра и митохондрии, аппарат Гольджи, рибосомы и другие органоиды. Под этим синцитием формируется толстая, состоящая из разнонаправленных волокон базальная пластинка. Далее наружная синцитиальная пластинка становится электронно-светлой и дегенерирует, так что от нее остается только электронно-плотный бугорчатый слой. Под базальной пластинкой на ранних этапах развития лежат крупные клетки, но цитоплазматических мостиков не наблюдалось. У инвазионных церкарий в хвостовой капсуле были обнаружены только крупные клетки без ядер и с электронно-светлой цитоплазмой. Вероятно, они выполняют опорную функцию.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 23-24-00376 и с использованием оборудования НП СПбГУ, ресурсных центров «Развитие молекулярных и клеточных технологий» и «Хромас».

В жизненном цикле дигенетических трематод (Digenea) присутствуют как эндопаразитические, так и свободноживущие стадии. У расселительных личинок гермафродитного поколения трематод — церкарий — часто имеются фоторецепторные структуры. Теме строения фоторецепторов у церкарий посвящено небольшое количество литературы. Были описаны пигментированные и непигментированные рабдомерные фоторецепторы у церкарий Cryptocotyle lingua (Rees, 1975), Trichobilharzia ocellata (Sopott-Ehlers et al., 2003) и предположительно цилиарные фоторецепторы у церкарий Schistosoma mansoni (Short, Gagné, 1975). На настоящий момент исследования фоторецепторных структур у церкарий проводились почти исключительно при помощи трансмиссионной микроскопии (ТЭМ). Можно заметить недостаток сравнительного материала по данной теме, а иммуноцитохимические методы практически не применялись к исследованию фоторецепторов.

Цель нашего исследования — описать строение пигментированных фоторецепторов и прилегающих к ним нервных структур у церкарий нескольких близких видов из семейства Notocotylidae и одного вида семейства Brachycladiidae (Campula oblonga). Для этого мы использовали методы иммуноцитохимии (мечение антителами к серотонину, FMRF-амиду, тирозинилированному тубулину) и конфокальную микроскопию. В дальнейшем мы планируем дополнить наше исследование результатами ТЭМ.

У исследованных церкарий выявляется ортогональная нервная система: парный церебральный ганглий, три пары продольных нервных стволов и поперечные комиссуры.

У нотокотилидных церкарий насчитывается шесть пар серотонинэргических нейронов. Одна пара лежит в передних углах церебрального ганглия, и две пары — в задних. Также две пары нейронов ассоциированы с дорзальными нервными стволами. Кроме того, присутствует пара нейронов в основании хвоста. FMRF-эргические элементы хорошо видны как в церебральном ганглии, так и во всех трех парах нервных стволов. Их скопление наблюдается в районе дорзальных прикрепительных карманов и ротовой присоски. Видны пара нервных тяжей (дорзальный и вентральный) в хвосте личинки. К глазным бокалам подходят нервные отростки, в него же заходят FMRF-эргические и серотонинэргические структуры.

У C. oblonga в церебральном ганглии расположены десять серотонинэргических нейронов: по пять с каждой стороны. Также две пары нейронов лежат вблизи вентральных нервных стволов в районе брюшной присоски. Присутствует пара нейронов в хвосте. К каждому пигментированному глазку подходят нервные структуры, но не видно, как они заходят в него, поскольку бокал небольшой.

Можно выделить следующие различия в строении фоторецепторов и нервной системы исследованных церкарий: более компактное расположение серотонинэргических нейронов у C. oblonga по сравнению с церкариями из семейства Notocotylidae, их разное количество, а также разное распределение нервных структур, прилегающих к фоторецепторам личинок.

Работа выполнена с использованием оборудования НП СПбГУ, ресурсных центров «‎Микроскопии и микроанализа» и «‎Хромас».

Тип Acanthocephala — группа эндопаразитов водных и наземных позвоночных, представленных во всех классах. Их таксономия до сих пор является предметом дискуссий. Наиболее надежными таксономическими признаками беспозвоночных считаются черты строения склеротизированных структур, в случае скребней — вооружения прикрепительного аппарата. Однако представители выделенных на их основе таксонов (Хохлова, 1986) в молекулярно-филогенетических исследованиях часто попадают в разные клады (Garcia-Varela et al., 2005). Следовательно, необходим поиск других таксономически значимых признаков методами сравнительной морфологии.

Помимо вооружения прикрепительного аппарата Монкс (Monks, 2001) обращает внимание на мускулатуру, обеспечивающую его подвижность — систему ретракторов. Предложенный им набор признаков заметно расширяется в серии работ по представителям рода Corynosoma, входящего в морфологически разнородное семейство Polymorphidae (Aznar et al., 1999, 2006, 2013, 2018). Причем построенная на их основе система рода, в отличие от системы полиморфид, согласуется с молекулярно-генетическими данными. Однако использование описанных в данных публикациях методов — реконструкции по гистологическим срезам и SEM по тонко отпрепарированным образцам — сделает последующий сравнительно-морфологический анализ очень медленным и трудоемким. Применение методов конфокальной микроскопии поможет значительно ускорить этот процесс.

Для исследования мной был выбран включенный в полифилетический род вид полиморфид Polymorphus phippsi, массовых высоко патогенных паразитов утиных северных морей. Образцы были окрашены TRITC-фаллоидином (впервые для скребней — успешно) и DAPI. По полученным изображениям описаны следующие черты строения системы ретракторов. Ретрактор шейки делится на две широких латеральных мышцы, срастающиеся на вентральной и дорсальной стороне середины передней части метасомы. Ретрактор хоботкового влагалища имеет трубчатую форму, и прикрепляется к стенке тела в районе перетяжки. От латеромедиальной стороны лемнисков отходят их ретракторы, прикрепленные ниже перетяжки. Ретинакулы (участки латеральных нервов, проходящие через полость тела, оплетенные мышечными волокнами) выходят из хоботкового влагалища латерально в задней его трети.

Подобное строение ретрактора хоботкового влагалища ранее было описано только для представителей рода Mediorhynchus (Schmidt, 1977), а ретракторов лемнисков — только у Rhadinorhynchus pristis (Monks, 2001), разделение ретрактора шейки на несколько мышц — только для представителей рода Corynosoma. Результаты данного исследования позволяют взглянуть совершенно по-новому на строение мускулатуры не только полиморфид в частности, но и в контексте плана строения Acanthocephala в целом.

Работа выполнена на базе Зоологического института РАН и ресурсного центра СПбГУ «Микроскопии и микроанализа» за счет средств гранта РНФ № 23-14-00329.

Ортонектиды (Orthonectida) — группа паразитов, характеризующаяся однохозяинным жизненным циклом. Он включает в себя стадию плазмодия, паразитирующего в разных беспозвоночных животных. Плазмодий отрождает свободноживущие стадии: самцов и самок. После их копуляции образуются личинки. Они покидают материнский организм и заражают нового хозяина.

Целью данного исследования была реконструкция строения нервной и рецепторной системы самки ортонектид вида Intoshia linei на основании данных, полученных при помощи 3D-сканирующей электронной микроскопии, а также данных предыдущих исследований.

Материал для данного исследования собирали на Баренцевом море (окрестности поселка Дальние Зеленцы (69°07' с.ш. и 36°05' в.д.). Немертин вида Lineus ruber, зараженных Intoshia linei, собирали и в последствии содержали в лаборатории. Выходящих самок ортонектид фиксировали и исследовали при помощи конфокальной микроскопии (обработка глиоксиловой кислотой, а также антителами на серотонин и FMRF-амид). Часть самок исследовали при помощи трансмиссионной электронной микроскопии и 3D-сканирующей электронной микроскопии. Полученные данные были проанализированы в программе Fiji и послужили основой для создания 3D модели строения нервной системы.

Нервная система самки Intoshia linei включает восемь серотонинергических клеток и шесть клеток содержащих FMRF-амид. При помощи окраски глиоксиловой кислотой нам удалось выявить еще девять предположительно рецепторных клеток, расположенных в передней части самки.

Данные полученные при помощи 3D-сканирующей электронной микроскопии подтвердили и уточнили результаты, полученные при помощи конфокальной микроскопии. Было выявлено 58 нервных клеток (из них 24 — рецепторные клетки). Это позволяет говорить о нервной системе Intoshia linei, как об одной из самых малоклеточных нервных систем среди Spiralia. Дорсально в передней части самки (в области первого–третьего ооцита) образуется ганглиозное скопление из 17 пар симметрично расположенных клеток.

Рецепторы самки Intoshia linei по данным электронной микроскопии представлены несколькими группами клеток. Три клетки расположены в передней части самки и дают отростки к апикальной поверхности самки. Рядом с ними лежат тела шести клеток двух морфологических групп, дающих отростки к латеральной поверхности самки. Мы предполагаем, что клетки одной из этих групп детектируются при окраске глиоксиловой кислотой. Также по направлению к заднему концу самки последовательно лежат еще два круга из шести и девяти рецепторных клеток. Все рецепторные клетки независимо дают отростки к ганглиозному скоплению нейронов в дорсальной части самки.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 23-24-00193 с использованием оборудования РЦ «Ресурсный центр микроскопии и микроанализа СПбГУ».

Для большинства Metazoa характерно наличие циркуляторных систем, необходимых для транспорта веществ внутри организма и интеграции отдельных его частей. Однако у многих организмов эти системы остаются слабо изученными.

Одними из наиболее видоизмененных ракообразных являются корнеголовые (Cirripedia: Rhizocephala). Тело самки — паразитирующей стадии — подразделено на два отдела. В гемоцеле хозяина расположена интерна — система столонов, поглощающих питательные вещества и участвующих в регуляции паразито-хозяинных отношений. Интерна посредством стебелька соединена с экстерной — вторым отделом тела, вынесенным над покровами хозяина и выполняющим репродуктивную функцию. Основные органы экстерны расположены в ее висцеральной массе. Снаружи экстерна покрыта мантией, ограничивающей мантийную полость с развивающимися личинками. Некоторые исследователи описывали систему лакун экстерны — полостей, соединенных через просвет стебелька с каналом в столонах интерны. Совокупность этих полостей играет роль циркуляторной системы у ризоцефал. Однако механизмы транспорта в этой системе и ее пространственная организация у большинства представителей корнеголовых оставались неизученными. Мы предполагаем, что в движении жидкости по лакунам может участвовать в том числе мускулатура экстерны. Ранее нами были описаны мышечная и лакунарная система у вида, относящегося к базальному семейству Peltogasterellidae, все представители которого являются модульными организмами. На данном этапе работы мы сосредоточились на строении экстерн представителей сем. Polyascidae — одного из наиболее продвинутых семейств “Kentrogonida”, некоторые виды которых являются модульными.

Целью нашей работы были визуализация и описание лакунарной и мышечной систем у двух представителей сем. Polyascidae — Polyascus polygeneus и Parasacculina pilosella. Исследование проводилось методами компьютерной микротомографии и конфокальной микроскопии.

С помощью компьютерной микротомографии были визуализированы участки лакунарной системы в основании экстерны, в стенке мантии, а также лакуна, связанная с висцеральной массой. Также были уточнены детали пространственной организации экстерн у представителей этого семейства. В частности, был обнаружен второй мезентерий, с помощью которого висцеральная масса соединяется с мантией, чего ранее в литературе описано не было. С помощью конфокальной микроскопии была визуализирована мышечная система в разных участках экстерн. Также впервые было показано, что мускулатура мантии закладывается не одномоментно по крайней мере у одного из видов — Polyascus polygeneus. В молодых экстернах присутствуют только продольные мышцы, позже появляются и кольцевые.

Полученные нами результаты вместе с уже имеющимися данными по другим видам ризоцефал позволяют пролить свет на эволюцию циркуляторных систем корнеголовых.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 24-24-00133.

Rhizocephala или корнеголовые ракообразные (Thecostraca: Cirripedia) — это облигатные паразиты ракообразных, в основном десятиногиx раков. Взрослые особи корнеголовыx утратили внешний облик, характерный для свободноживущих усоногих, а физиология и жизненный цикл этих организмов претерпели ряд радикальных изменений в ходе адаптации к эндопаразитическому образу жизни. В теле взрослых самок выделяют две части: интерну — сеть трофических ветвящихся столонов внутри тела хозяина, и экстерну — мешковидную структуру, выполняющую репродуктивную функцию.

Некоторые виды корнеголовых могут встречаться на нескольких видах хозяев, в то время как для других была показана строгая видоспецифичность. Наш объект исследования — Peltogasterella gracilis из семейства Peltogasterellidae — был отмечен у следующих Decapoda: Pagurus middendorffii, P. pectinatus, P. brachiomastus. Особи этого паразита из разных видов хозяев имеют некоторые отличия в строении тела: размер экстерн, локализация, степень и характер ветвления столонов. Это может указывать на то, что под названием P. gracilis объединяется комплекс криптических видов. Целью нашей работы было выяснить, является ли P. gracilis одним видом с широким кругом хозяев или же это группа криптических видов.

Сбор материала был проведен на морской биологической станции «Восток» ННЦМБ ДВО РАН. К настоящему времени мы выделили ДНК из 6 образцов P. gracilis, обнаруженных на P. middendorffii. Мы использовали следующие методы: выделение ДНК из экстерн фенол-хлороформом, а также при помощи ионообменной смолы Chelex. Для полученных изолятов мы провели ПЦР по двум маркерам: фрагмент 18S рДНК и фрагмент митохондриального гена cox1. Мы планируем секвенировать по Сэнгеру данные фрагменты для определения видового статуса паразита.

Кроме того, для подтверждения видовой принадлежности хозяев, мы также собираемся провести секвенирование фрагментов 18S рДНК, полученных из мышц раков-отшельников.

В дальнейшем, в случае выявления генетических различий межвидового уровня между паразитами из разных хозяев, мы планируем поиск возможных морфологических различий методами гистологии и трансмиссионной электронной микроскопии.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 24-24-00133.

Metchnikovellida — особая группа микроспоридий, родственных грибам паразитических протистов. Все известные мечниковеллиды паразитируют в грегаринах из кишечников морских беспозвоночных, то есть являются гиперпаразитами. Для них характерно наличие двух типов спорогонии в жизненом цикле. Первый тип спорогонии заканчивается формированием множества спор либо напрямую в цитоплазме хозяина, либо под мембраной вакуоли. Второй тип спорогонии приводит к образованию толстостенных «цист» (споровый мешок, spore sac) со спорами. Число спор в цистах может варьировать либо быть постоянным, в зависимости от вида. Цисты так же могут либо формироваться непосредственно в цитоплазме хозяина, либо в вакуолях. Обычно первый тип спорогонии предшествует образованию цист. Форма и размер цист, их морфологические особенности представляют собой видоспецифические признаки. Известно, что филогенетически мечниковеллиды — сестринская группа «высших» микроспоридий, однако характер взаимоотношений внутри группы все еще остается неясным в виду малой выборки видов мечниковеллид. Таким образом, нами была поставлена цель изучить новый вид мечниковеллид из архигрегарин полихеты Travisia forbesii, охарактеризовать его морфологию и проанализировать филогенетическое положение на дереве мечниковеллид.

В цитоплазме архигрегарин Selenidium sp. из полихет Travisia forbesii, собранных на сублиторали Кандалакшского залива Белого моря и Зеленецкой губы Баренцева моря, были обнаружены цисты и свободные споры мечниковеллид. Цисты имели удлиненную форму с небольшим изгибом. Они имели одно полярное утолщение (пробку) и содержали 12–14 округлых спор. Как цисты, так и свободные споры находились непосредственно в цитоплазме клетки-хозяина. Вопреки каноническому представлению о развитии мечниковеллид, у этого гиперпаразита часто наблюдается формирование цист в отсутствии следов протекания свободной спорогонии. Сочетание морфологических особенностей и круга хозяев отличает изученные изоляты от других известных видов мечниковеллид. Анализ фрагмента (1345 п.о.) гена малой субъединицы рРНК показал, что изученные изоляты из двух географически удаленных точек практически идентичны (идентичность 99,2% — очень высокое сходство для дивергентных последовательностей мечниковеллид) и образуют новую линию мечниковеллид, что также подтверждается результатами филогеномного анализа. Кроме того, анализ молекулярных данных продемонстрировал наличие смешанной мечниковеллидной инфекции в популяции полихет T. forbesii губы Зеленецкой. Помимо последовательности морфологически охарактеризованной мечниковеллиды мы обнаружили еще одну последовательность предполагаемого второго гиперпаразита, морфологические характеристики которого не известны. Выявленные у баренцевоморских травизий гиперпаразиты образуют две новые и хорошо поддерживаемые линии на филогеномном дереве мечниковеллид. Данное исследование подтвердило широкое распространение смешанных инфекций мечниковеллид в гемипопуляциях грегарин полихет.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 23-74-00071.

Молекулярно-генетические данные в рамках интегративного подхода уже позволили уточнить видовое разнообразие во многих группах трематод. Изучение генетической изменчивости трематод на внутривидовом уровне все еще не так распространено, несмотря на ценность таких данных, в частности, для определения видовых границ в проблемных случаях и для понимания биогеографических закономерностей. Этим вопросам посвящены наши исследования трематод, циркулирующих в прибрежье морей севера Палеарктики, в частности — микрофаллид.

Базовый жизненный цикл представителей рода Microphallus включает трех хозяев. Первые промежуточные хозяева — в основном моллюски отряда Littorinimorpha. Роль второго промежуточного хозяина играют ракообразные (крабы, раки), в которых формируются инвазионные для окончательных хозяев (птиц) метацеркарии. У ряда видов второй промежуточный хозяин выпадает, и метацеркарии формируются в моллюске. Один из таких видов, M. pseudopygmaeus, отличается также тем, что имеет необычно широкую специфичность к первому промежуточному хозяину. Трематоды рода Microphallus имеют широкое географическое распространение, однако внутривидовая генетическая изменчивость была исследована только для M. piriformes (Repkin et al., 2020).

Мы сравнили внутривидовую географическую генетическую изменчивость для трех видов рода Microphallus: M. similis, M. pseudopygmaeus и M. piriformes. Были исследованы образцы из разных регионов: Белое море, Баренцево море (Восточный Мурман, побережье Норвегии), Печорское море, побережье Исландии, Охотское море. В качестве маркерной последовательности был амплифицирован и секвенирован фрагмент гена cox1. Получено 17 последовательностей для разных изолятов M. piriformes, 15 — M. similis и 45 — M. pseudopygmaeus. В анализ также включены данные из GenBank.

Внутривидовая изменчивость составила 0,8–1,7%, а межвидовая — 9–14%. По всей видимости, среди изолятов M. pseudopygmaeus и M. similis есть примеры гостальной генетической изменчивости, но для более определенных выводов об этом необходимо исследовать больше образцов. Изоляты M. similis и M. pseudopygmaeus из Охотского моря относительно обособлены, но довольно близки к европейским гаплотипам, что говорит о возможном потоке генов между удаленными популяциями.

Паттерны изменчивости в исследованных видах рода Microphallus можно объяснить особенностями их жизненных циклов и набором хозяев, что будет подробнее освещено в докладе.

Работа поддержана грантом РНФ 23-14-00329; секвенирование выполнено в Научном парке СПбГУ (ресурсный центр «Развитие молекулярных и клеточных технологий»).

Большой интерес представляет изучение трансарктических миграций, поскольку они связаны с периодами изменений климатических условий. При этом историю расселения различных животных редко рассматривают в связке с их паразитами. В последнее время ведутся активные исследования по биогеографии арктического региона, однако данных по паразитическим организмам все еще мало. Трематоды — это крупная группа паразитических плоских червей со сложным жизненным циклом, включающим обычно последовательную смену двух или трех хозяев. Их партеногенетические поколения развиваются в моллюсках, в качестве второго промежуточного хозяина используются все основные таксоны животных, а взрослые особи гермафродитного поколения обитают в позвоночных. Наличие в жизненном цикле нескольких хозяев делает трематод интересным объектом для филогеографических исследований.

Brachyphallus crenatus и Hemiurus levinseni — это трематоды семейства Hemiuridae, использующие морских и проходных рыб в качестве окончательных хозяев. Они распространены по всему Северному полушарию, поэтому являются хорошими модельными объектами для изучения миграционных процессов. Широкий ареал может быть признаком того, что мы имеем дело с комплексами криптических видов, это делает объект изучения как более сложным, так и более интересным.

Цель этого исследования — предложить сценарий распространения видов B. crenatus и H. levinseni в морях севера и востока России. Для достижения этой цели мы поставили перед собой следующие задачи: используя молекулярно-генетические методы, уточнить видовой статус для B. crenatus и H. levinseni, исследовать внутривидовое генетическое разнообразие и реконструировать филогеографические связи популяций B. crenatus и H. levinseni.

Материал был собран в период с 2020 по 2023 год на Белом, Баренцевом, Печорском, Восточно-Сибирском, Охотском и Японском морях. На настоящий момент для десяти изолятов B. crenatus из всех перечисленных морей и для трех изолятов H. levinseni из Белого и Баренцева морей была выделена ДНК, проведена ПЦР и последующее секвенирование для фрагментов 28S рДНК и ITS2. Анализ последовательностей этих фрагментов пока не выявил изменчивости внутри B. crenatus и H. levinseni, что позволяет предполагать отсутствие в нашем материале криптических видов. В дальнейшем планируется включить в анализ больше образцов, чтобы изучить внутривидовое генетическое разнообразие с помощью вариабельных маркеров: фрагментов генов cox1 и nad1.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 23-24-00376 и с использованием оборудования НП СПбГУ, ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Современные исследования филогенетических отношений Metazoa зачастую опираются на молекулярно-генетические данные. При установлении филогенетического положения видов используются относительно вариабельные ядерный ген 28S рРНК и транскрибируемые спейсеры (ITS) (Littlewood, Johnston, 1995; Chow et al, 2009). Митохондриальные же гены (цитохром-оксидазы 1–3, NAD-H-дегидрогеназа и др.) варьируют в пределах вида и используются при баркодинге популяций (Goodall-Copestake et al, 2012) либо включаются в филогенетические реконструкции по конкатенированным матрицам (Havird, Santos, 2014). Также молекулярные маркеры подходят для видовой идентификации типовых образцов в рамках таксономических ревизий, включающих поиск признаков, позволяющих составлять монофилетические таксоны.

Это актуально для скребней (Garcia-Varela et al., 2005) — облигатных эндопаразитов позвоночных, использующих членистоногих как промежуточных хозяев (Петроченко, 1956). В особенности применение молекулярных маркеров важно при работе с семейством Polymorphidae, чьи представители характеризуются широким спектром окончательных хозяев и морфологических адаптаций к ним (Хохлова, 1986; Петроченко, 1958). Для полиморфид зафиксированы случаи создания серий типовых образцов, в которые были включены особи, относящиеся к разным видам (Nickol et al., 2002). Следовательно, необходимо включать в серии только ваучерные препараты для подтверждения видовой принадлежности типовых образцов. Длина гена 28S рРНК у полиморфид — 2779 п.н., потому он амплифицируется в виде четырех перекрывающихся фрагментов, что делает идентификацию типовых образцов с его помощью крайне затратной и трудоемкой. Митохондриальные маркеры слишком вариабельны для видовой идентификации. Поэтому в рамках данной работы мы рассматриваем маркер ITS1 как оптимальный.

Однако для него в ряде фаунистических работ были показаны различия между образцами, отнесенными к одному виду (Westram et al, 2011; Zittel et al, 2018). В других публикациях подобный полиморфизм по ITS1 не выявлен (Kralova-Hromadova et al., 2003). Следовательно, пригодность данного маркера для видовой идентификации необходимо тестировать отдельно для каждого исследуемого таксона. Такое тестирование мы провели для четырех видов массовых паразитов птиц Палеарктики — Polymorphus phippsi, P. magnus, Profilicollis botulus и Filicollis anatis. Амплификация проводилась с использованием оригинальных праймеров. Затем проводился сравнительный анализ внутривидовых и межвидовых филогенетических расстояний.

Работа выполнена на базе Зоологического института РАН за счет средств гранта РНФ № 23-14-00329.